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熒光顯微鏡
研究細胞內(nèi)物質(zhì)吸收的儀器
基本信息
| 中文名 | 熒光顯微鏡 |
| 外文名 | Fluorescence microscope |
| 用途 | 研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸?shù)?/div> |
| 注意事項 | 在暗室中檢查，按照說明書使用等 |
| 釋義 | 物質(zhì)進行定性和定量研究工具之一 |
| 光源 | 紫外線 |
收起
鑒別
熒光顯微鏡
1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；
2.光源為紫外光，波長較短，分辨力率高于普通顯微鏡；
3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人眼。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標本的熒光圖像。
工作原理
光源
熒光顯微鏡工作原理
超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間后，則需要高壓啟動（約為15000V），啟動后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。
國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低。
中國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。
濾色系統(tǒng)
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點。如德國產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍色玻璃，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；中國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拼音的第一個字母，B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當(dāng)于BG12。
1．激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)波長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上波長的光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的光（藍到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。
反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區(qū)吸收少，反射達90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。
聚光鏡
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適于低、中倍放大的標本觀察。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強激發(fā)光的強度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細微熒光顆粒。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時進行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
物鏡
各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。
落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分（紫外和紫藍）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標本，使標本受到激發(fā)，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分（綠、黃、紅等），對濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標本的熒光處在可見光長波區(qū)，可透過濾鏡而到達目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時比透射光源強。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標本等的直接觀察。研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。
CCD
使用范圍
一般情況下，單獨使用熒光顯微鏡即可以達到想要的成像效果，但在某些情況下，比如說當(dāng)熒光比較微弱的情況下，僅僅通過熒光顯微鏡并不能達到理想的拍攝效果，或者大家希望可以將拍攝的熒光圖片上傳的電腦生面預(yù)覽，修改甚至發(fā)表學(xué)術(shù)論文，這時候沒有熒光顯微鏡CCD是不能達到要求的。
產(chǎn)品特點
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕捉能力，能夠捕捉到極其微弱的熒光，因此成像能力好，此外，很多熒光冷CCD生產(chǎn)上搜對此類CCD作了制冷處理，使得此類CCD的噪音大大降低，信噪比得以很大的提高。由于其方便應(yīng)用效果，此類CCD相機被廣泛應(yīng)用于熒光顯微鏡。
標本制作要求
熒光顯微鏡的標本制作要求
1、載玻片
載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時需用石英玻璃載玻片。
2、蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發(fā)光，也可用于涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起到不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標本。
3、標本
組織切片或其他標本不能太厚，若太厚激發(fā)光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。
4、封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。
5、鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質(zhì)量略有影響。
使用方法
（1）打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱15min才能達到最亮點。
（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。
（3）用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。
（4）放置標本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。
注意事項
（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
（2）應(yīng)在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標本。
（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。
（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。
（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。
（6）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)。長時間的激發(fā)光照射標本，會使得熒光衰減和消失現(xiàn)象，故應(yīng)盡可能縮短照射時間。暫時不觀察時可用擋光板遮蓋激發(fā)光。
（7）標本觀察時候應(yīng)采用無熒光油，應(yīng)避免眼睛直視紫外光源。
研究發(fā)現(xiàn)
參考資料
[1]
國際最新研發(fā)出一低成本裝置 可將智能手機轉(zhuǎn)化成熒光顯微鏡 · 環(huán)球網(wǎng)[引用日期2023-03-10]
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作者
