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紫外－可見分光光度法
鑒別、檢查和測定雜質的方法
紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內測定物質的吸光度，用于鑒別、雜質檢查和定量測定的方法。當光穿過被測物質溶液時，物質對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。因此，通過測定物質在不同波長處的吸光度，并繪制其吸光度與波長的關系圖即得被測物質的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長λmax和最小吸收波長λmin。物質的吸收光譜具有與其結構相關的特征性。因此，可以通過特定波長范圍內樣品的光譜與對照光譜或對照品光譜的比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個特定波長處的吸收比值而鑒別物質。用于定量時，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進行比較或采用吸收系數法求算出樣品溶液的濃度。
原理或術語
光譜法（spectrometry）是基于物質與電磁輻射作用時，測量由物質內部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動、轉動光譜，電子自旋及核自旋譜等。
分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發(fā)光強度，對該物質進行定性和定量分析的方法。常用的技術包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
常用檢測儀器：紫外-可見分光光度計。
原理如下：
單色光輻射穿過被測物質溶液時，在一定的濃度范圍內被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系可以用朗伯-比爾定律表述如下：
式中
A為吸光度；
T為透光率；
E為吸收系數，常用的表示方法，其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時的吸光度數值；
c為100ml溶液中所含物質的重量（按干燥品或無水物計算），g；
l（L）為液層厚度，cm。
分光光度計
紫外-可見分光光度計由5個部件組成：①輻射源。必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍350～2500納米），氘燈或氫燈（180～460納米），或可調諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱吸收池。供盛放試液進行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為0.5～10厘米。④檢測器，又稱光電轉換器。常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導攝像管或光電二極管矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點。⑤顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級的光度計，常備有微處理機、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數據和操作條件都顯示出來。
儀器類型則有：單波長單光束直讀式分光光度計，單波長雙光束自動記錄式分光光度計和雙波長雙光束分光光度計。
儀器校正檢定
1.波長
由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長經常會略有變動，因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正；鈥玻璃在波長279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化，使用時應注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（
）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。
儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±1nm，500nm附近±2nm。
2.吸光度的準確度
波長/nm | 235（最小） | 257（最大） | 313（最小） | 350（最大） |
吸收系數( )的規(guī)定值 | 124.5 | 144.0 | 48.6 | 106.6 |
吸收系數( )的許可范圍 | 123.0～ 126.0 | 142.8～ 146.2 | 47.0～ 50.3 | 105.5～ 108.5 |
3.雜散光的檢查
對溶劑要求
測定法
測定時，除另有規(guī)定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長±2nm以內，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測得的吸光度會偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增大為準，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數，或由儀器自動扣除空白讀數后再計算含量。
當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。
1.鑒別和檢查分別按各品種項下規(guī)定的方法進行。
2.含量測定一般有以下幾種方法。
（1）對照品比較法
按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度∶
式中
為供試品溶液的濃度；
（2）吸收系數法
按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時，吸收系數通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。
（3）計算分光光度法
計算分光光度法有多種，使用時應按各品種項下規(guī)定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。
（4）比色法
用比色法測定時，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，再根據供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度，并求出其含量。
也可取對照品溶液與供試品溶液同時操作，顯色后，以相應的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按上述（1）法計算供試品溶液的濃度。
除另有規(guī)定外，比色法所用空白系指用同體積溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理制得。
參考資料
[1]
藥物分析法：紫外可見分光光度法 · 醫(yī)學教育網[引用日期2021-07-30]
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