全基因組測(cè)序（對(duì)未知基因組物種進(jìn)行個(gè)體測(cè)序）
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全基因組測(cè)序
對(duì)未知基因組物種進(jìn)行個(gè)體測(cè)序
全基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測(cè)序。 1986年， Renato Dulbecco是最早提出人類基因組測(cè)序的科學(xué)家之一。他認(rèn)為如果能夠知道所有人類基因的序列，對(duì)癌癥的研究將會(huì)很有幫助。美國(guó)能源部（DOE）與美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH），分別在1986年與1987年加入人類基因組計(jì)劃。除了美國(guó)之外，日本在1981年就已經(jīng)開(kāi)始研究相關(guān)問(wèn)題，但是并沒(méi)有美國(guó)那樣積極。到了1988年，詹姆士·華生（DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)者之一）成為NIH的基因組部門主管。1990年開(kāi)始國(guó)際合作。1996年，多個(gè)國(guó)家召開(kāi)百慕達(dá)會(huì)議，以2005年完成測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)，分配了各國(guó)負(fù)責(zé)的工作，并且宣布研究結(jié)果將會(huì)及時(shí)公布，并完全免費(fèi)。
基本信息
| 中文名 | 全基因組測(cè)序 |
| 測(cè)序目標(biāo) | 2005年 |
| 準(zhǔn)備時(shí)間 | 19世紀(jì)80-90年代 |
| 國(guó)際合作 | 1990年 |
研究結(jié)果
①NCI-H209細(xì)胞系基因組中，共檢測(cè)到22,910個(gè)堿基替換、65個(gè)插入缺失（Indels）、58個(gè)結(jié)構(gòu)變異；在基因組的編碼區(qū)，除了發(fā)現(xiàn)RB1 和TP53基因發(fā)生點(diǎn)突變和MLL2基因由于發(fā)生了G>T的顛換，從而產(chǎn)生了pre-stop codon外，有94個(gè)點(diǎn)突變直接改變了氨基酸序列，有36個(gè)屬同義突變。
②特定的堿基及其周圍序列易被煙氣中的多環(huán)芳烴和丙烯醛誘變。在NCI-H209細(xì)胞系基因組中，G>T/C>A是最為普遍的顛換現(xiàn)象，發(fā)生頻率為34%；其次是G>A/C>T（21%）和A>G/T>C（19%）；CpG島外的CpG二核苷酸多發(fā)生G>T顛換，而CpG島內(nèi)的CpG二核苷酸多發(fā)生G>C顛換，說(shuō)明煙氣中的致癌物偏好引起甲基化的CpG二核苷酸發(fā)生顛換。
③檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)（Transcription-coupled repair）和表達(dá)相關(guān)的修復(fù)（Expression-linked repair）在起作用。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)作用機(jī)制：鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤上大的加合物是吸煙過(guò)程中所釋放的致癌化學(xué)物質(zhì)引起DNA損傷的主要形式，這些大的加合物阻止了轉(zhuǎn)錄鏈上RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而轉(zhuǎn)錄受阻的RNA聚合酶招募核苷酸剪切修復(fù)相關(guān)因子對(duì)受損的核苷酸進(jìn)行修復(fù)以避免突變發(fā)生。在TP53基因突變的肺癌細(xì)胞中，G>T顛換常出現(xiàn)在非轉(zhuǎn)錄鏈，表明在轉(zhuǎn)錄鏈上相同的損傷已被識(shí)別和修復(fù)。在本研究中，轉(zhuǎn)錄鏈上G和A堿基替換頻率比非轉(zhuǎn)錄鏈上少，由此看來(lái)嘌呤是煙氣致癌物質(zhì)主要誘變靶標(biāo)。另外，在NCI-H209細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈上發(fā)生不同類型的突變（G>T、A>G、A>T）兩條鏈基因表達(dá)水平也有差異，這就意味著轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)機(jī)制識(shí)別、修復(fù)不同加合物損傷的能力不同。
表達(dá)相關(guān)的修復(fù)（Expression-linked repair）作用機(jī)制：這是一種新的、更為普遍的修復(fù)機(jī)制，即，高表達(dá)的基因中，轉(zhuǎn)錄鏈及非轉(zhuǎn)錄鏈的突變頻率都較低。在NCI-H209細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)錄鏈和非轉(zhuǎn)錄鏈上發(fā)生G>A的突變，兩條鏈上基因表達(dá)水平都很高，這就說(shuō)明表達(dá)相關(guān)的修復(fù)作用比轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)作用更為重要。
④在SCLC細(xì)胞系中，CHD7基因發(fā)生了重排。在NCI-H209細(xì)胞系中，CHD7基因3~8外顯子發(fā)生連續(xù)重復(fù)，而另外2個(gè)LU-135、NCI-H2171細(xì)胞系則攜帶PVT1-CHD7融合基因，說(shuō)明在肺癌中CHD7基因發(fā)生了周期性重排。
以上結(jié)果表明，第二代測(cè)序技術(shù)已成為研究與癌癥相關(guān)的基因突變過(guò)程、細(xì)胞損傷修復(fù)路徑、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)有力工具。
簡(jiǎn)介
技術(shù)路線
提取基因組DNA，然后隨機(jī)打斷，電泳回收所需長(zhǎng)度的DNA片段（0.2~5kb），加上接頭，進(jìn)行基因簇cluster制備或電子擴(kuò)增E-PCR，最后利用Paired-End（Solexa）或者M(jìn)ate-Pair（SOLiD）的方法對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序。然后對(duì)測(cè)得的序列組裝成Contig，通過(guò)Paired-End的距離可進(jìn)一步組裝成Scaffold，進(jìn)而可組裝成染色體等。組裝效果與測(cè)序深度與覆蓋度、測(cè)序質(zhì)量等有關(guān)。目前常用的組裝有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。
原理
雙末端（Paired-End）測(cè)序原理
測(cè)序深度（SequencingDepth）：測(cè)序得到的堿基總量（bp）與基因組大小（Genome）的比值，它是評(píng)價(jià)測(cè)序量的指標(biāo)之一。測(cè)序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系，測(cè)序帶來(lái)的錯(cuò)誤率或假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)隨著測(cè)序深度的提升而下降。重測(cè)序的個(gè)體，如果采用的是雙末端或Mate-Pair方案，當(dāng)測(cè)序深度在10~15X以上時(shí)，基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率控制均得以保證。
測(cè)序深度對(duì)基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率的影響
全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通過(guò)序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性（SNP），插入缺失（InDel，Insertion/Deletion）和結(jié)構(gòu)變異（SV，StructureVariation）位點(diǎn)。SBC可以協(xié)助客戶，通過(guò)生物信息手段，分析不同個(gè)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)完成SNP及基因組結(jié)構(gòu)注釋。
測(cè)序覆蓋度：基因組被測(cè)序得到的堿基覆蓋的比例；測(cè)序覆蓋度是反映測(cè)序隨機(jī)性的指標(biāo)之一；測(cè)序序深度與覆蓋度之間的關(guān)系可以過(guò)Lander-Waterman Model（1988）來(lái)確定。當(dāng)深度達(dá)到5X時(shí)，則可覆蓋基因組的約99.4%以上。
全基因組測(cè)序
分析流程
1．?dāng)?shù)據(jù)量產(chǎn)出
總堿基數(shù)量、TotalMappingReads、UniquelyMappingReads統(tǒng)計(jì)，測(cè)序深度分析。
2．一致性序列組裝
與參考基因組序列（Referencegenomesequence）的比對(duì)分析，利用貝葉斯統(tǒng)計(jì)模型檢測(cè)出每個(gè)堿基位點(diǎn)的最大可能性基因型，并組裝出該個(gè)體基因組的一致序列。
3．SNP檢測(cè)及在基因組中的分布
提取全基因組中所有多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)合質(zhì)量值、測(cè)序深度、重復(fù)性等因素作進(jìn)一步的過(guò)濾篩選，最終得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集。并根據(jù)參考基因組信息對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行注釋。
4．InDel檢測(cè)及在基因組的分布
在進(jìn)行mapping的過(guò)程中，進(jìn)行容gap的比對(duì)并檢測(cè)可信的shortInDel。在檢測(cè)過(guò)程中，gap的長(zhǎng)度為1~5個(gè)堿基。對(duì)于每個(gè)InDel的檢測(cè)，至少需要3個(gè)Paired-End序列的支持。
5．StructureVariation檢測(cè)及在基因組中的分布
SBC能夠檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)變異類型主要有：插入、缺失、復(fù)制、倒位、易位等。根據(jù)測(cè)序個(gè)體序列與參考基因組序列比對(duì)分析結(jié)果，檢測(cè)全基因組水平的結(jié)構(gòu)變異并對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行注釋。
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