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核酸內(nèi)切酶
不具堿基特異性的酶
基本信息
| 中文名 | 核酸內(nèi)切酶 |
| 外文名 | endonuclease |
| 類型 | DNaseⅠ、DNaseⅡ |
| 性質(zhì) | 大都不具堿基特異性 |
簡介
30多年前，當(dāng)人們?cè)趯?duì)噬菌體（細(xì)菌病毒）的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種"限制"病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點(diǎn)切開DNA，將基因切割成小的基因片段。
當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開來的時(shí)候，以NEB為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內(nèi)切酶。除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)。人們正在從數(shù)以千計(jì)的細(xì)菌及古細(xì)菌中尋找新的限制性內(nèi)切酶。而對(duì)已測序的原核基因組數(shù)據(jù)分析表明，限制性內(nèi)切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的細(xì)菌和古細(xì)菌似乎都能編碼限制性內(nèi)切酶。
限制性內(nèi)切酶的主要功能是保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染，這一觀點(diǎn)已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機(jī)制的一部分行使其功能。當(dāng)一個(gè)沒有限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌被病毒感染時(shí)，大部分病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個(gè)有限制性內(nèi)切酶的同種細(xì)菌被成功感染的比率顯著下降。出現(xiàn)更多的限制性內(nèi)切酶將會(huì)起到多重保護(hù)作用；而一個(gè)擁有4到5種各自獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶將會(huì)使細(xì)胞堅(jiān)不可摧。
上世紀(jì)80年代，科學(xué)家開始克隆并表達(dá)限制性內(nèi)切酶。克隆技術(shù)由于將限制性內(nèi)切酶的表達(dá)與原有細(xì)胞環(huán)境分離開來，避免了原細(xì)胞中其它內(nèi)切酶的污染，從而提高了酶的純度。此外，克隆技術(shù)提高了限制性內(nèi)切酶的產(chǎn)量，簡化了純化過程，使得生產(chǎn)成本顯著降低；克隆的基因很容易進(jìn)行測序分析，表達(dá)出的蛋白也能進(jìn)行X射線結(jié)晶分析，這使得我們對(duì)于克隆產(chǎn)物更加確定。
限制酶圖
同一DNA用不同的限制酶進(jìn)行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點(diǎn)，由此建立的位點(diǎn)圖譜有助于對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
限制性核酸內(nèi)切酶分析技術(shù)是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)行流行病學(xué)研究的有效方法，對(duì)動(dòng)物檢疫有很重要的實(shí)用意義，尤其對(duì)區(qū)別進(jìn)出境動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來毒有很重要的意義。
作用及分類
限制性核酸內(nèi)切酶(以下簡稱限制性酶)是一類識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內(nèi)切方式水解DNA，產(chǎn)生5’-P和3’-OH末端。 1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌體時(shí)發(fā)現(xiàn)了宿主控制性現(xiàn)象。Arber及其同事用放射性同位素標(biāo)記證明，噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，據(jù)此他們提出了限制 - 修飾酶假說。對(duì)于一個(gè)宿主細(xì)胞，限制性酶及 DNA甲基化酶是其細(xì)胞中的一對(duì)酶，它們對(duì)DNA底物有相同的識(shí)別順序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子內(nèi)部拆卸水解，甲基化酶是修飾，DNA分子經(jīng)修飾后，就可逃避限制性酶的識(shí)別，而甲基化酶只修飾宿主自身的DNA，從而避免了限制性酶對(duì)自身DNA的破壞。
限制性酶主要分為三種類型：Ⅰ型限制酶為復(fù)合功能酶，具有限制-修飾兩種功能，但在 DNA鏈上沒有固定的切割位點(diǎn)，一般在離切割位點(diǎn)1kb到幾kb的地方隨機(jī)切割，不產(chǎn)生特異性片段。Ⅲ型酶與Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特異性的切割位點(diǎn)，但這兩類酶對(duì) DNA酶切分析的意義不大，通常所說的限制性內(nèi)切酶是指Ⅱ型酶，它能夠識(shí)別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸順序，產(chǎn)生特異性的DNA片段。
2.識(shí)別序列及消化產(chǎn)物的末端結(jié)構(gòu) 限制性酶的識(shí)別序列，大部分具有雙軸對(duì)稱性結(jié)構(gòu)或稱回文序列，如EcoRI的識(shí)別序列為：
GAA
TTC
橫軸
CTT
AAG
縱軸
將縱軸一側(cè)的序列以橫軸為中心旋轉(zhuǎn)180°，則縱軸兩側(cè)的序列相互對(duì)稱，這種結(jié)構(gòu)又稱為雙重對(duì)稱結(jié)構(gòu)。大部分酶的識(shí)別序列長度為4-6個(gè)核苷酸。4核苷酸序列在DNA鏈中出現(xiàn)頻率高，對(duì)一隨機(jī)排列的DNA分子來說，理論值為1/44，因此4核苷酸識(shí)別序列的限制性酶在DNA鏈上切點(diǎn)多，產(chǎn)生片段的數(shù)目多，長度短，顯示出酶的特異性較低。對(duì)于5和6核苷酸識(shí)別序列的酶，出現(xiàn)頻率分別為1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出現(xiàn)頻率低，酶的特異性強(qiáng)，而8核苷酸識(shí)別位點(diǎn)在DNA鏈中出現(xiàn)機(jī)率更低(1/48 )，特導(dǎo)性更強(qiáng)，可提供更長的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的雙軸對(duì)稱性序列，其回文識(shí)別序列被個(gè)或幾個(gè)其他核苷酸所間隔，如BglⅠ，這種酶的特異性比識(shí)別長度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(約10種，如BbVⅠ等)，其識(shí)別序列不表現(xiàn)為回文結(jié)構(gòu)，它們降解雙鏈DNA時(shí)，酶切點(diǎn)大部分不在識(shí)別序列內(nèi)，而是與識(shí)別序列相距5至13個(gè)核苷酸殘基不等。
限制性酶切片段的末端結(jié)構(gòu)：限制性酶不但有特定的識(shí)別序列，并且任何一種酶切割 DNA鏈時(shí)，總是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯鍵的3’位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5’端帶磷酸單酯基團(tuán)，而3’末端則為游離羥基。因此某一種酶的全部產(chǎn)物的末端具有相同的結(jié)構(gòu)。根據(jù)切點(diǎn)序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，產(chǎn)物的末端可分為粘性末端和平末端兩類。粘性末端指酶切后DNA片段末端帶有1-4個(gè)核苷酸殘基的單鏈結(jié)構(gòu)，而片段兩端突出的單鏈具有互補(bǔ)性，突出的單鏈因部位的不同，又可分為5’-與3’-粘性末端兩種，突出的單鏈帶5’磷酸單酯的稱5’-粘性末端，而突出的單鏈含3’-羥基則稱3’-粘性末端。平末端指酶切后，片段為齊頭末端結(jié)構(gòu)。在DNA體外重組時(shí)，粘性末端是DNA連接酶的有效底物，有很高的連接效率。
影響及因素
限制性酶切反應(yīng)速度與底物的性質(zhì)有很大的關(guān)系，底物的單雙鏈結(jié)構(gòu)、分子的構(gòu)型、DNA鏈中酶識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目以及位點(diǎn)附近的序列等都影響著酶的催化反應(yīng)。共價(jià)閉合環(huán)(超螺旋構(gòu)型)DNA比其相應(yīng)的線性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋構(gòu)型DNA徹底降解，需要的酶量就大。對(duì)于DNA-RNA雜合雙鏈的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8種酶切時(shí)，結(jié)果其 DNA鏈可被切割，但酶用量比雙鏈DNA大20-50倍。部分限制性酶還可切割單鏈DNA，如 Hae Ⅲ等。
每一種限制性酶都有自身的識(shí)別特異性，在通常酶反應(yīng)條件下，特異性不會(huì)改變，但在特殊條件下，某些酶的特異性會(huì)隨之改變，如當(dāng)反應(yīng)緩沖液的pH由7.5升高至8.5，或甘油濃度超過5%，或用Mn艸代替Mg艸時(shí)EcoRI的識(shí)別序列由原來的GAATTC變?yōu)锳ATT，結(jié)果是DNA鏈上切點(diǎn)數(shù)量增加，產(chǎn)物片段變小，因此在不合適的反應(yīng)條件下，限制性酶可表現(xiàn)與原來特異性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要確保酶解條件，注意底物DNA的純度，盡可能防止酶的第二活性。
反應(yīng)液中鹽的濃度是至關(guān)重要的，因此要根據(jù)所使用的酶來確定鹽的濃度。限制性酶對(duì)鎂離子的要求并不嚴(yán)格，5-30mmol/L均可作用。限制性酶的用量，一般為每微克DNA 1-5單位，為保險(xiǎn)起見以過量3-5倍為宜，但最好先作預(yù)實(shí)驗(yàn)。
從理論上講，延長反應(yīng)時(shí)間可以節(jié)省酶，但長時(shí)間消化受酶的穩(wěn)定性、雜酶的影響等因素的制約。國產(chǎn)酶不宜超過1.5小時(shí)，其他酶一般也以1-2小時(shí)為宜。酶切反應(yīng)的溫度一般在 37℃，只有少數(shù)酶要求特殊反應(yīng)溫度，如TaqⅠ要求65℃。低于37℃時(shí)大部份酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。許多酶可用熱處理(65℃)10-15分鐘使酶反應(yīng)終止，但并非所有酶都能熱終止，不能熱終止的酶可用過量EDTA終止或用酚提取來終止。
操作及應(yīng)用
1.操作步驟 以動(dòng)物病毒為例說明酶切反應(yīng)步驟。
(1) 病毒DNA的提取和純化 當(dāng)繁殖病毒的細(xì)胞出現(xiàn)80%-100%的細(xì)胞病變時(shí)(CPE)，收獲并凍融三次使細(xì)胞破裂釋放出病毒，3 000r/min離心10分鐘，吸出上清，加10% SDS至終濃度為1%，于56℃水浴作用30分鐘，加等體積的飽和酚，混勻10 000r/min離心10-15分鐘，取上清反復(fù)抽提至界面無蛋白質(zhì)為止，取上清用乙醚去酚數(shù)次，真空除去乙醚，然后加2.5倍預(yù)冷無水乙醇，沉淀核酸，12 000r/min離心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗滌兩次，pH8.0 TE緩沖液溶解，取少量用紫外分光光度計(jì)測其含量和純度，其余置－20℃貯存?zhèn)溆谩?/span>
(2) 酶切反應(yīng) 將病毒DNA用TE溶解為大約0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切緩沖液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/ L MgCl2，1mmol/L DTT），5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50μl，在振蕩器上溫和振蕩幾秒鐘，然后稍稍離心(3 000r/mmin)數(shù)秒，以使管壁液體集中于管底，37℃恒溫水浴中孵育1小時(shí)，65℃水浴作用10分鐘，或用EDTA終止反應(yīng)。
(3) 電泳 依據(jù)酶切片段的大小選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠作為支持物進(jìn)行電泳，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)DNA作分子量參照物，經(jīng)溴乙錠(EB)或硝酸銀染色，在相應(yīng)的光源下觀察結(jié)果并拍攝記錄電泳圖譜。
以上為酶切反應(yīng)操作的基本過程。如果進(jìn)行多酶切反應(yīng)，則要考慮反應(yīng)緩沖液要基本適用于所用的各種酶。若兩種以上的酶對(duì)緩沖液要求不同，如鹽濃度要求不同時(shí)，先進(jìn)行低鹽要求的酶切反應(yīng)，再進(jìn)行高鹽要求的反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)溫度要求不一的也是先進(jìn)行低溫度酶切，再進(jìn)行高溫度酶切。
2.酶切分析應(yīng)用 限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中占有極其重要的地位，幾乎每一個(gè)研究領(lǐng)域都離不開限制性內(nèi)切酶，其應(yīng)用非常廣泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，將龐大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重組和組建新質(zhì)粒；建立DNA的物理圖譜等。
用限制性內(nèi)切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis REA)病原微生物DNA已成為一種常用的方法，通過酶切消化DNA，然后電泳染色呈現(xiàn)大小不一的片段，對(duì)這些片段的遷移率及數(shù)量進(jìn)行分析，便可了解到病原微生物遺傳物質(zhì)的一定特性，在此基礎(chǔ)上采用雙酶切割或雜交等方法，則可推測出片段的排列順序和酶切位點(diǎn)，從而推斷出DNA間存在的相似性或差異性，對(duì)于動(dòng)物病毒尤其是對(duì)疫苗毒、野毒及變異毒株的檢測具有重要的意義。
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