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多酚氧化酶
用作酶制劑等的蛋白體
酶的簡介
酶蛋白具有一般蛋白質(zhì)的特性，在高溫或低溫條件下有易變性失活的特點。各類酶均有其活性的最適溫度范圍，一般在30C～50℃范圍內(nèi)酶活性最強。酶若失活、變性，則就喪失了催化能力。酶的催化作用具有專一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物質(zhì)氧化，聚合成茶多酚的氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白質(zhì)分解為氨基酸。茶葉加工就是利用酶具有的這種特性，用技術(shù)手段鈍化或激發(fā)酶的活性，使其沿著茶類所需的要求發(fā)生酶促反應(yīng)而獲得各類茶特有的色香味。如綠茶加工過程中的殺青就是利用高溫鈍化酶的活性，在短時間內(nèi)制止由酶引起的一系列化學變化，形成綠葉綠湯的品質(zhì)特點。紅茶加工過程中的發(fā)酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物質(zhì)在多酚氧化酶的催化下發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，生成茶黃素、茶紅素等氧化產(chǎn)物，形成紅茶紅葉紅湯的品質(zhì)特點。
研究概況
自然界分布
植物中的多酚氧化酶及作用
在植物（如蘋果、荔枝、菠菜、馬鈴薯、豆類、茶葉、桑葉、煙草等）組織中，PPO是與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起的，天然狀態(tài)無活性，但將組織勻漿或損傷后PPO被活化，從而表現(xiàn)出活性。在果蔬細胞組織中，PPO存在的位置因原料的種類、品種及成熟度的不同而有差異，綠葉中PPO活性大部分存在于葉綠體內(nèi)；馬鈴薯塊莖中幾乎所有的亞細胞部分都含有PPO，含量大約與蛋白質(zhì)部分相同；在茶葉中的PPO分為游離態(tài)和束縛態(tài)，前者主要存在于細胞液中屬可溶態(tài)PPO，而后者則主要存在于葉綠體、線粒體等細胞器中，與這些細胞器的膜系統(tǒng)或其他特異部位結(jié)合呈不溶態(tài)，ThanarajS.N.（1990）研究了茶樹新梢中PPO活性及多酚含量對紅茶品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)PPO活性強，多酚含量高，對紅茶品質(zhì)有利，相反則利于綠茶的生產(chǎn)；新鮮的蘋果中，多酚氧化酶幾乎全部存在于葉綠體和線粒體中。從這兩部分分別制備的PPO，其底物專一性稍有差異。劉乾剛認為，PPO在細胞內(nèi)除了存在于葉綠體及線粒體上外，細胞壁也可能存在PPO，且對發(fā)酵產(chǎn)生影響，細胞只要輕微破損便有PPO的作用。多酚氧化酶是一種質(zhì)體酶，有些研究人員認為多酚氧化酶可能僅存在于質(zhì)體中，缺乏質(zhì)體的組織就不存在多酚氧化酶，例如篩管和篩胞等，但是有質(zhì)體的組織也可能沒有多酚氧化酶，如C4植物葉。含有質(zhì)體的植物組織不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有質(zhì)體的植物組織中。
隨分子生物學的發(fā)展，像西紅柿、蘋果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大學趙東等對茶樹多酚氧化酶的克隆及其序列進行了比較。從已經(jīng)克隆的多酚氧化酶的基因看，均屬于基因家族，多則6-7個基因。這些基因的表達具有時空差異和組織特異性（PPO在幼齡組織中表達，在成熟組織中不表達），表明多酚氧化酶的基因在植物中所起的作用不同。高等植物組織發(fā)生褐變主要是PPO作用的結(jié)果，PPO催化多酚氧化為醌，醌聚合并與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基酸反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生黑色素沉淀。
微生物漆酶
漆酶是三大類多酚氧化酶中作用底物最廣的一類。漆酶最早是在1883年由Yoshida首先從漆樹液中發(fā)現(xiàn)的，后來人們又從大量的真菌體中發(fā)現(xiàn)了漆酶。漆酶來源很多，結(jié)構(gòu)各異，不同來源的漆酶表現(xiàn)出來的催化特性相差較大。即便是同一來源，如同一白腐菌菌種，也可分泌出不同性質(zhì)的漆酶組分，包括氧化能力、最適pH、底物專一性等，因此催化氧化作用也各不相同。漆酶分子中的銅離子是漆酶催化反應(yīng)的活性中心，在催化氧化過程中起決定作用。
在真菌中，漆酶大多分布在擔子菌（Basidimycetes）、多孔菌（Polyporus）、子囊菌（A-somycetes）、脈孢菌（Neurospora）、柄孢殼菌（Po-dospora）和曲霉菌（Aspergillus）等真菌中。擔子菌中的白腐菌是目前獲得漆酶的主要來源。Givaudan等還從稻根上的生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）中分離出細菌漆酶。
黃乾明等以粗毛栓菌(Trametes gallica）為出發(fā)菌，通過紫外誘變處理其擔抱子、PDA-RBBR平板變色法初篩、ABTS法測定培養(yǎng)液漆酶酶活力復(fù)篩，獲得1株漆酶高產(chǎn)誘變菌株SAH-12。
黃俊等（2006）從森林樹木根部土壤中分離得1株具有漆酶活性的細菌菌株，并鑒定該細菌屬于克雷伯氏菌(Klebsiella）屬，命名其為Klebsiella sp-601。這是首例報道Klebsiella細菌具有漆酶活性。
微生物酪氨酸酶
有報道說，一種假單胞菌（Pseudomonas sp.）具有高產(chǎn)酪氨酸酶的能力，另一種細菌即弗氏檸檬桿菌（Cibrobacter freundii）在L一酪氨酸誘導(dǎo)下能高效表達酪氨酸酶的催化活性，經(jīng)小試試驗可獲得L-多巴產(chǎn)量9.5g/L，為其中試生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
現(xiàn)狀展望
植物PPO的研究現(xiàn)狀及展望
PPO與抗病性的關(guān)系人們已進行了廣泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染過程中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用，這主要包括了酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白家族PPO通過催化木質(zhì)素及醌類化合物形成，構(gòu)成保護性屏蔽而使細胞免受病菌的侵害，也可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。目前已比較成功的有：黃瓜對黑星病的抗性，蘋果對輪紋病的抗性，香蕉對束頂病的抗性，檸檬對流膠病的抗性，甘薯對蔓割病的抗性，水稻對白葉枯病的抗性等等。
茶葉中所有化學成分中，兒茶素與多酚氧化酶尤為重要，除綠茶、黃茶外，各種茶葉的加工都是基于兒茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所謂的“發(fā)酵”過程。有的學者在紅碎茶加工中，利用茶幼果作為外源PPO的載體，以一定比例用于紅碎茶加工過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能明顯提高成茶的TF含量，減少TB含量。還有的學者進行了內(nèi)源酶發(fā)酵研究，以期望能在茶飲料中有所應(yīng)用，改善滋味。
多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，PPO催化果蔬原料中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)氧化生成黑色素，嚴重影響制品的營養(yǎng)，風味及外觀品質(zhì)。這些情況對生產(chǎn)者與消費者均是不希望看到的，僅在少數(shù)幾種食品的生產(chǎn)中，人們利用了PPO的作用，如茶葉、咖啡、黑葡萄中的多酚氧化酶。
微生物PPO的研究現(xiàn)狀及展望
隨著微生物發(fā)酵投入少、見效快、易控制等特點的凸顯，開發(fā)微生物中的多酚氧化酶成了研究者關(guān)注的熱點。微生物中的漆酶對氧化酚類或芳胺類等多種底物的氧化起催化作用，從而使其在含酚廢水的處理、環(huán)境中酚類毒物的降解、飲料加工、食用和藥用菌生產(chǎn)、飼料工業(yè)及醫(yī)藥衛(wèi)生等各個領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。而利用微生物發(fā)酵合成酪氨酸酶也已成為研制治療白癜風、帕金森病和老年癡呆癥等疾患藥物的努力方向。
由于自然界中存在著大量結(jié)構(gòu)不同的多酚類物質(zhì)，而催化這些酚類物質(zhì)氧化的多酚氧化酶也是不同的。如果從微生物中篩選出有效的酶源或者利用酶修飾、基因異源表達和基因工程菌的構(gòu)建等技術(shù)創(chuàng)造出有效的微生物酶源，這將著深遠意義。
活性測定
常用檢壓法和分光光度法。前者應(yīng)用多酚氧化酶（PPO）可催化兒茶素等底物在有氧條件下的氧化還原反應(yīng)，根據(jù)底物的氧化速率與單位酶濃度和單位時間內(nèi)的耗氧量成正比這一原理，用瓦氏呼吸儀測定反應(yīng)過程中的耗氧量求得PPO活性的大小，此方法設(shè)備簡便，但操作復(fù)雜，誤差較大。后者利用鄰苯二酚和D-兒茶素在PPO催化下生成有色產(chǎn)物。其顯色物質(zhì)在460納米處有最大吸收，吸收值在單位時間內(nèi)的變化和單位酶活性成正比，計算PPO活性強度。操作方法簡便，重現(xiàn)性好。與檢壓法原理相似的方法有氧電極法，應(yīng)用也較多。
制備方法
由絲狀菌（Alternaria; Asp. niger; Corio-lus)或擔子菌（Cyathus; Polyporus cinereus; Pycno porus coc-cineus; Polyporus; Trametes) 的培養(yǎng)液，用室溫以下的水提取后，再在低溫下用冷的乙醇、含水乙醇或丙酮處理而得。亦可由蘑菇提取而得。
應(yīng)用領(lǐng)域
- 酶制劑
用于紅茶制造等。
儲存運輸
密封包裝后貯于陰冷處。
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