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信使RNA
單鏈核糖核酸
基本信息
| 中文名 | 信使RNA |
| 外文名 | mRNA |
| 模版 | DNA的一條鏈 |
| 性質(zhì) | 單鏈核糖核酸 |
| 學科 | 生物 |
概述
信使核糖核酸
信使RNA是指導蛋白質(zhì)生物合成的直接模板。mRNA 占細胞內(nèi)RNA總量的2%~ 5%，種類繁多，其分子大小差別非常大。
信使RNA（mRNA）是一大類RNA分子，它將遺傳信息從DNA傳遞到核糖體，在那里作為蛋白質(zhì)合成模板并決定基因表達蛋白產(chǎn)物肽鏈的氨基酸序列。RNA聚合酶將初級轉(zhuǎn)錄物mRNA（稱為前mRNA）轉(zhuǎn)錄成加工過的成熟mRNA，這種成熟的mRNA被翻譯成蛋白質(zhì)。
信使RNA
將密碼子翻譯成氨基酸的過程需要另外兩種類型的RNA：轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）。tRNA介導密碼子的識別并提供相應的氨基酸，rRNA是核糖體蛋白質(zhì)制造機械的核心組成部分。
mRNA的存在首先由Jacques Monod和Fran?oisJacob提出，隨后由Jacob，Sydney Brenner和Matthew Meselson于1961年在加州理工學院發(fā)現(xiàn)。
原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯一般是偶聯(lián)的，真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體則需經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工，加工為成熟的mRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成信息體后才開始工作。
原核與真核生物mRNA的結(jié)構特點也不同。真核生物mRNA具有5‘帽子和3’多聚A尾巴，原核生物沒有這樣的首尾結(jié)構。
單順反子與多順反子mRNA
翻譯產(chǎn)物僅是單個蛋白質(zhì)鏈（多肽）的mRNA稱為單順反子mRNA。大多數(shù)真核mRNA都屬于單順反子mRNA。多順反子mRNA攜帶幾個開放閱讀框（ORF），每個開放閱讀框都能被翻譯成一條多肽，這些多肽通常具有相似的功能，通常構成最終復合蛋白的不同亞基。這些多肽鏈對應的DNA片斷則位于同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)，享用同一對起點和終點。細菌和古細菌中的大多數(shù)mRNA是多順反子的。
mRNA的環(huán)化
在真核生物中，由于eIF4E和poly（A）結(jié)合蛋白之間的相互作用，mRNA分子形成環(huán)狀結(jié)構，這兩種結(jié)合蛋白都與eIF4G結(jié)合，形成mRNA-蛋白-mRNA橋。環(huán)化促進核糖體在mRNA上的循環(huán)，提高翻譯效率，且確保僅有完整的mRNA得到翻譯。
發(fā)現(xiàn)
儲存在DNA分子中的這種遺傳信息能在復制中產(chǎn)生更多的拷貝，并翻譯成蛋白質(zhì)。DNA的功能構成了信息的流動，遺傳信息如何轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)呢？轉(zhuǎn)錄就是其中的重要的一環(huán)。基因表達時以DNA的一條鏈為模板合成RNA，這一過程就是轉(zhuǎn)錄（transcription）。催化合成RNA的酶叫做RNA聚合酶（RNA polymerase）。RNA和DNA結(jié)構相似，所不同之處在于：⑴RNA一般以單鏈形式存在；⑵RNA中的核糖其C′-2不脫氧；⑶尿苷（U）取代了DNA中的胸苷。細胞中的RNA分成三種：mRNA（信使RNA），tRNA（轉(zhuǎn)運RNA）和rRNA（核糖體RNA）。它們的功能各不相同。mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板，tRNA是轉(zhuǎn)運特異氨基酸的運載工具，rRNA是合成蛋白質(zhì)的裝置。mRNA的堿基序列，決定著蛋白質(zhì)裝配時氨基酸的序列。
1955年Brachet用洋蔥根尖和變形蟲進行了實驗；若加入RNA酶降解細胞中的RNA，則蛋白質(zhì)合成就停止，若再加入從酵母中提取的RNA，則又可以重新合成一些蛋白質(zhì)，這就表明，蛋白質(zhì)的合成是依賴于RNA。
同年Goldstein和Plaut用同位素標記變形蟲（Amoeba proteus）RNA前體，發(fā)現(xiàn)標記的RNA都在核內(nèi)，表明RNA是在核內(nèi)合成的。在標記追蹤（pulse-chase）實驗中，用短脈沖標記RNA前體，然后將細胞核轉(zhuǎn)移到未標記的變形蟲中。經(jīng)過一段時間發(fā)現(xiàn)被標記的RNA分子已在細胞質(zhì)中，這就表明RNA在核中合成，然后轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)內(nèi)，而蛋白質(zhì)就在細胞質(zhì)中合成，因此RNA就成為在DNA和蛋白質(zhì)之間傳遞信息的信使的最佳候選者。
1956年Elliot Volkin和 Lawrence Astrachan作了一項很有意思的觀察：當E.coli被T2感染，迅速停止了RNA的合成，但噬菌的RNA卻開始迅速合成。用同位素脈沖一追蹤標記表明噬菌的RNA在很短的時間內(nèi)就進行合成，但很快又消失了，表明RNA的半衰期是很短的。由于這種新合成的RNA的堿基比和T2的DNA堿基比相似，而和細菌的堿基比不同，所以可以確定新合成的RNA是T2的RNA。由于T2感染細菌時注入的是DNA，而在細胞里合成的是RNA，可見DNA是合成RNA的模板。最令人信服的證據(jù)來自DNA-RNA的雜交實驗。Hall.B.D和Spiegeman,S，將T2噬菌體感染E.coli后立即產(chǎn)生的RNA分離出來，分別與T2和E.coli的DNA進行分子雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種RNA只能和T2的DNA雜交形成“雜種”鏈，而不能和E.coli的DNA進行雜交。表明T2產(chǎn)生的這種RNA（即mRNA）至少和T2的DNA中的一條鏈是互補的。
Brenner,s. Jacob,F.和Meselson(1961）進行了一系列的的實驗（圖12-2），他們將E.coli培養(yǎng)在15N/13C的培養(yǎng)基中，因此合成的RNA和蛋白都被“重”同位素所標記。也就是說凡是“重”的核糖體，RNA和蛋白都是細菌的，然后用T2感染E.coli，細菌的RNA停止合成，而開始合成T2的RNA此時用普通的“輕”培養(yǎng)基（14N/12C），但分別以32P來標記新合成的T2 RNA，以35S標記新合成的T2蛋白，因此任何重新合成的核糖體，RNA，及蛋白都是“輕”的但帶但有放射性同位素。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后破碎細胞，加入過量的輕的核糖體作對照，進行密度梯度離心，結(jié)果“輕”的核糖體上不具有放射性，“重”的核糖體上具有32P和35S，表明⑴T2未合成核糖體，“輕”核糖體卻是后加放的。⑵T2翻譯時是借用了細菌原來合成的核糖體，所以核糖體并無特異性，核糖體上結(jié)合的mRNA，其序列的特異性才是指導合成蛋白質(zhì)的遺傳信息，從而提出了mRNA作為“信使”的證據(jù)。因此他們將這種能把遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì)上的物質(zhì)稱為“信使”。他們預言⑴這種“信使”應是一個多核苷酸；⑵②其平均分子量不小于5′105（假定密碼比是3），足以攜帶一個基因的遺傳信息；⑶它們至少是暫時連在核糖體上；⑷其堿基組成反映了DNA的序列；⑸它們能高速更新。Volkin和Astrachan發(fā)現(xiàn)高速更新的RNA似乎完全符合以上條件。Jacob和Monod將它定名為信使RNA（Messenger RNA）或mRNA。
合成與加工
轉(zhuǎn)錄
轉(zhuǎn)錄是指由DNA合成RNA的過程。在轉(zhuǎn)錄期間，RNA聚合酶根據(jù)需要將一個基因的DNA拷貝成mRNA，這個過程在真核生物和原核生物中是相似的。
與原核生物明顯不同的是，真核RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程中與mRNA加工酶結(jié)合，因此，真核生物的mRNA加工可以在轉(zhuǎn)錄開始后快速進行。短壽命的未加工或部分加工的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品稱為前體mRNA或pre-mRNA；一旦加工完全，它被稱為成熟mRNA。
真核pre-mRNA加工
mRNA的加工在真核生物、細菌和古細菌中差異很大。實質(zhì)上，非真核mRNA在轉(zhuǎn)錄時是成熟的，除極少數(shù)情況外不需要加工。然而，真核pre-mRNA需要大量加工。
5’端加帽子：5‘ 帽（也稱為RNA帽，RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽）就是一個經(jīng)修飾的鳥嘌呤核苷酸，在轉(zhuǎn)錄開始不久后就被添加到新產(chǎn)生的真核mRNA的“前”即5'末端。 5’帽由末端7-甲基鳥苷殘基組成，它通過5'-5'-三磷酸鍵與第一轉(zhuǎn)錄出的核苷酸連接。它的存在對于核糖體的識別和對mRNA的保護至關重要。
3’端加尾：是指聚腺苷酰基部分與mRNA分子的共價連接。在真核生物中，大多數(shù)信使RNA（mRNA）分子在3'末端被多聚腺苷酸化。Poly A尾巴和與其結(jié)合的蛋白質(zhì)有助于保護mRNA免于被核酸外切酶降解。3’端加尾對于轉(zhuǎn)錄終止，從細胞核輸出mRNA和翻譯也很重要。 原核生物中的mRNA也常被3’端加尾，但此時的poly（A）尾巴促進而不是防止核酸外切酶對mRNA的降解。
mRNA的轉(zhuǎn)運
真核生物和原核生物之間的另一個區(qū)別是mRNA的轉(zhuǎn)運。由于真核轉(zhuǎn)錄和翻譯是在不同的細胞器內(nèi)進行的，真核mRNA必須從細胞核輸出到細胞質(zhì)。 這一過程可能受不同信號通路的調(diào)節(jié)。成熟的mRNA通過其加工的修飾被識別，在結(jié)合帽結(jié)合蛋白CBP20和CBP80及轉(zhuǎn)錄/輸出復合物（TREX）后通過核孔被輸出到細胞質(zhì)。
mRNA的翻譯
因為原核mRNA不需要加工或轉(zhuǎn)運，所以原核生物mRNA在核糖體的翻譯可以在轉(zhuǎn)錄結(jié)束后立即開始。因此，可以說原核生物的mRNA翻譯與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)發(fā)生。
已經(jīng)加工并轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)的真核mRNA（即成熟mRNA）在核糖體的翻譯發(fā)生在細胞質(zhì)中自由漂浮的核糖體中，或者通過信號識別顆粒導向到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。因此，與原核生物不同，真核生物的mRNA翻譯不直接與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。在某些情況下甚至可能發(fā)生這樣的情況，即mRNA水平的降低卻伴隨著蛋白質(zhì)水平的增加。
相關課程
第一節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄生成RNA
一、定義
一轉(zhuǎn)錄單位
二、RNA聚合酶
二酶的分類：
2．細菌則具有復雜的多亞基結(jié)構（450Kd），可識別并轉(zhuǎn)錄超過1000個轉(zhuǎn)錄單位。
3．真核生物的酶有多種，根據(jù)a－鵝膏蕈堿（環(huán)狀8肽，阻斷RNA延伸）的抑制作用可分為三類：聚合酶A對它不敏感，分布于核仁，轉(zhuǎn)錄核糖體RNA；聚合酶B對低濃度敏感，存在于核質(zhì)，轉(zhuǎn)錄信使RNA；聚合酶C位于核質(zhì)，對高濃度敏感，轉(zhuǎn)錄小分子量RNA，如轉(zhuǎn)運RNA、5SRNA等。各種RNA聚合酶都是由10-15種不同亞基組成的多亞基復合物。
三酶的構成：大腸桿菌的全酶有5個亞基（α2ββ’ωσ），含2個鋅。β催化形成磷酸二酯鍵，β’結(jié)合模板，σ亞基稱為起始因子，可使RNA聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合到啟動子上。ββ’ωσ稱為核心酶。σ亞基在不同菌種間變動較大，而核心酶比較恒定。酶與不同啟動子的結(jié)合能力不同，不同啟動因子可識別不同的啟動子。σ70識別啟動子共有序列，σ32識別熱休克基因，σ60在氮饑餓時起作用。σ通過隨機移動起作用，不需解鏈。
三、轉(zhuǎn)錄過程
分為起始、延長和終止三個階段。起始包括對雙鏈DNA特定部位的識別、局部（17bp）解鏈以及在最初兩個核苷酸間形成磷酸二酯鍵。第一個核苷酸摻入的位置稱為轉(zhuǎn)錄起點。
起始后起始因子離開，核心酶構象改變，沿模板移動，轉(zhuǎn)錄生成雜交雙鏈（12bp）。隨后DNA互補鏈取代RNA鏈，恢復DNA雙螺旋結(jié)構。延伸速度為50nt/s，酶移動17nm。錯誤幾率為10-5。
聚合酶到達終點時，在終止輔助因子的幫助下停止反應，酶和RNA鏈脫落，轉(zhuǎn)錄結(jié)束。
四、啟動子和轉(zhuǎn)錄因子
三真核生物：復雜，差異較大。
1．信使RNA的啟動子通常有三個保守區(qū)，－25到－30有TATA框，是解鏈位置，并決定轉(zhuǎn)錄起點；－75位置有CAAT框，與RNA聚合酶的結(jié)合有關；更上游還有GC框，某些轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合。后兩個稱為上游因子，對轉(zhuǎn)錄起始頻率有較大影響；
2． 小RNA的啟動子在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)部，有一些輔助因子幫助RNA聚合酶識別。
五、終止子和終止因子
一定義
1． 簡單終止子，回文區(qū)有一段富含GC對的序列，回文后有寡聚尿苷。
六、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
一遺傳信息的表達有時序調(diào)控和適應調(diào)控，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是關鍵環(huán)節(jié)，因為這是表達的第一步。轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要發(fā)生在起始和終止階段。
二操縱子是細菌基因表達和調(diào)控的單位，有正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)因子。阻遏蛋白的作用屬于負調(diào)控。環(huán)腺苷酸通過其受體蛋白（CRP）促進轉(zhuǎn)錄，可促進許多誘導酶的合成。操縱子可構成綜合性調(diào)控網(wǎng)絡，如SOS反應等。對終止子也有調(diào)控作用，如衰減子。
第二節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工
一、原核生物
一核糖體RNA：大腸桿菌共有7個核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄單位，每個轉(zhuǎn)錄單位由16S、23S、5SRNA和若干轉(zhuǎn)運RNA基因組成。16S和23S之間常由轉(zhuǎn)運RNA隔開。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在RNA酶III的作用下裂解產(chǎn)生核糖體RNA的前體P16和P23，再由相應成熟酶加工切除附加序列。前體加工時還進行甲基化，產(chǎn)生修飾成分，特別是a-甲基核苷。N4,2’-O二甲基胞苷（m4Cm）是16S核糖體RNA特有成分。5S核糖體RNA一般無修飾成分。
二轉(zhuǎn)運RNA：有60個基因，其加工包括：
1．內(nèi)切酶在兩端切斷，大腸桿菌RNA酶P是5’成熟酶；
3．3’端加上CCAOH，由轉(zhuǎn)運RNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化，某些轉(zhuǎn)運RNA已有，切除附加序列后即露出；
三信使RNA：細菌多數(shù)不用加工，轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的。也有少數(shù)多順反子信使RNA必須由內(nèi)切酶切成較小的單位，然后翻譯。如核糖體大亞基蛋白與RNA聚合酶的b亞基基因組成混合操縱子，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)RNA酶III切開，各自翻譯。因為RNA聚合酶的合成水平低得多，切開有利于各自的翻譯調(diào)控。較長的RNA會產(chǎn)生高級結(jié)構，不利于翻譯，切開可改變其結(jié)構，從而影響其功能。
二、真核生物
一核糖體RNA：基因拷貝數(shù)多，在幾十到幾千之間。基因成簇排列在一起，由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄生成一個較長的前體，哺乳動物為45S。核仁是rRNA合成與核糖體亞基生物合成的場所。RNA酶III等核酸內(nèi)切酶在加工中起重要作用。5SRNA基因也是成簇排列的，由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，經(jīng)加工參與構成大亞基。核糖體RNA可被甲基化，主要在核苷2’羥基，比原核生物甲基化程度高。多數(shù)核糖體RNA沒有內(nèi)含子，有些有內(nèi)含子但不轉(zhuǎn)錄。
二轉(zhuǎn)運RNA：由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，加工與原核相似，但3’端的CCA都是后加的，還有2’-O-甲基核糖。
三信使RNA：真核生物編碼蛋白質(zhì)的基因以單個基因為轉(zhuǎn)錄單位，但有內(nèi)含子，需切除。信使RNA的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是分子量很大的前體，在核內(nèi)加工時形成大小不等的中間物，稱為核內(nèi)不均一RNA(hnRNA）。其加工過程包括：
1．5’端加帽子：在轉(zhuǎn)錄的早期或轉(zhuǎn)錄終止前已經(jīng)形成。首先從5’端脫去一個磷酸，再與GTP生成5’，5’三磷酸相連的鍵，最后以S-腺苷甲硫氨酸進行甲基化，形成帽子結(jié)構。帽子結(jié)構有多種，起識別和穩(wěn)定作用。
三、RNA的拼接
一轉(zhuǎn)運RNA的拼接：由酶催化，酶識別共同的二級結(jié)構，而不是序列。通常內(nèi)含子插入到靠近反密碼子處，與反密碼子配對，取代反密碼子環(huán)。第一步由內(nèi)切酶切除插入序列，不需ATP；第二步由RNA連接酶連接，需要ATP。
二四膜蟲核糖體RNA的拼接：某些四膜蟲26S核糖體RNA基因中有一個內(nèi)含子，其拼接只需一價和二價陽離子及鳥苷酸或鳥苷存在即可自發(fā)進行。其實質(zhì)是磷酸酯的轉(zhuǎn)移反應，鳥苷酸起輔助因子的作用，提供游離3’羥基。
三信使RNA：真核生物編碼蛋白質(zhì)的核基因的內(nèi)含子屬于第二類內(nèi)含子，左端為GT，右端為AG。先在左端切開，產(chǎn)生的5’末端與3’端上游形成5’，2’-磷酸二酯鍵，構成套索結(jié)構。然后內(nèi)含子右端切開，兩個外顯子連接起來。通過不同的拼接方式，可形成不同的信使RNA。
第三節(jié)RNA的復制
一、噬菌體QbRNA的復制
其RNA是單鏈，正鏈，侵入大腸桿菌后立即翻譯，產(chǎn)生復制酶的b亞基，與宿主的三個亞基（α為核糖體蛋白，γ、δ均為肽鏈延長因子）構成復制酶，進行復制。先以正鏈為模板合成負鏈，再根據(jù)負鏈合成正鏈。合成負鏈時需要宿主的兩個蛋白因子，合成正鏈則不需要，所以可大量合成。病毒的蛋白質(zhì)合成受RNA高級結(jié)構的調(diào)控。
二、病毒RNA復制的主要方式
一病毒含正鏈RNA，先合成復制酶，復制后合成其他蛋白質(zhì)進行裝配。如噬菌體Qb及灰質(zhì)炎病毒。
第四節(jié)RNA生物合成的抑制劑
一、堿基類似物
有些人工合成的堿基類似物能干擾和抑制核酸的合成。作用方式有以下兩類：
一作為代謝拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有關酶類。如6-巰基嘌呤進入體內(nèi)后可轉(zhuǎn)變?yōu)閹€基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成。可作為抗癌藥物，治療急性白血病等。此類物質(zhì)一般需轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳暮塑账岵拍鼙憩F(xiàn)出抑制作用。
二進入核酸分子，形成異常RNA或DNA，影響核酸的功能并導致突變。5-氟尿嘧啶類似尿嘧啶，可進入RNA，與腺嘌呤配對或異構成烯醇式與鳥嘌呤配對，使A-T對轉(zhuǎn)變?yōu)镚-C對。因為正常細胞可將其分解，而癌細胞不能，所以可選擇性抑制癌細胞生長。
二、DNA模板功能抑制物
二放線菌素類：可與DNA形成非共價復合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。
三、RNA聚合酶抑制劑
一利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶活性。
二利鏈菌素：與細菌RNA聚合酶b亞基結(jié)合，抑制RNA鏈的延長。
mRNA分子的合成始于轉(zhuǎn)錄，并最終以降解結(jié)束。在被翻譯之前，真核mRNA分子通常需要大量加工和轉(zhuǎn)運，而原核mRNA分子則不需要。真核mRNA分子和它周圍的蛋白質(zhì)一起被稱為信使RNP。
實驗方法
對mRNA的檢測、分析及定量 | ||||
方法 | 目標RNA的類型 | 同時定量的目標RNA的數(shù)量 | 用途 | 缺點 |
Northern雜交 | mRNA | 通常為一個，最多幾個。 | 主要用于估測不同組織、細胞中目標mRNA的分子質(zhì)量，可用于mRNA的粗略定量。 | 需要大量RNA；只可同時檢測一個或最多幾個mRNA；與PCR方法相比，靈敏度差、耗時。 |
RNA酶保護 | mRNA | 通常為一個，但是如果使用混合探針，最多可同時檢測12種mRNA。 | 主要用于對不同類型細胞或組織中目標mRNA的檢測和定量。 | 需要特異性的反義雜交探針（通常帶放射性）。RNA酶保護法遠比Northern雜交靈敏，但靈敏度還是不如PCR法。 |
傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄PCR | mRNA | 通常為一個，但是也可努力做到多重檢測系統(tǒng)。 | 由于反轉(zhuǎn)錄PCR取決于反轉(zhuǎn)錄步驟和擴增步驟所使用的引物，經(jīng)常可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果；反轉(zhuǎn)錄步驟變化大；另外，產(chǎn)物量的測定方法有很多缺陷，如低分辨率和低靈敏度。 | |
實時定量PCR | mRNA及miRNA | 通常為一個，但也可檢測多個目標RNA，參見Stanley和Szewczuk（2005）等的研究結(jié)果，他們在單個多重反應中同時分析過72個mRNA。 | 是檢測目標RNA的一種高靈敏及高精度的方法。即使目標RNA在細胞中拷貝數(shù)極少也適用。實時PCR比其他方法更靈敏、更快、更精確。最近10年內(nèi)是檢測細胞中mRNA相對豐度的主要方法。不僅可用于mRNA的檢測，也可用于microRNA的檢測（參見Chen et al. 2005；Benes and Castoldi 2010）。 | 市場上銷售的幾種商業(yè)設備采用的檢測方法不同。另外，已出版了數(shù)百種描述實時定量PCR的方案。實時PCR的每個步驟都缺乏標準，導致可靠性和可重復性的比較即使可能，也很困難（Nolanet al. 2006；Derveaux etal. 2010）。對實時PCR提出了一些合理的建議和標準，規(guī)定了實時PCR結(jié)果發(fā)表所必需的最少信息量，也許會有助于解決目前的困境（Bustinet al. 2009；Bustin 2010）。 |
降解
同一細胞內(nèi)的不同mRNA具有不同的壽命（穩(wěn)定性）。在細菌細胞中，單個mRNA可以存活數(shù)秒至超過一小時，但平均壽命為1至3分鐘，因此，細菌mRNA的穩(wěn)定性遠低于真核mRNA。哺乳動物細胞mRNA的壽命從幾分鐘到幾天不等。mRNA的穩(wěn)定性越高，從該mRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)越多。 mRNA的有限壽命使細胞能夠快速改變蛋白質(zhì)合成以響應其不斷變化的需求。有許多機制可導致mRNA的降解。
真核mRNA的降解
真核細胞的翻譯和mRNA衰變之間存在著平衡。正在被翻譯的mRNA被核糖體，真核起始因子eIF-4E和eIF-4G以及poly（A）結(jié)合蛋白結(jié)合，不能接觸外泌體復合物，mRNA得到保護。mRNA的poly（A）尾巴被特異性外切核酸酶縮短，該核酸外切酶通過RNA上的順式調(diào)節(jié)序列和反式作用RNA結(jié)合蛋白的組合定位到特定mRNA。 Poly（A）尾巴被去除破壞了mRNA的環(huán)狀循環(huán)結(jié)構并降低了帽結(jié)合復合體的穩(wěn)定性，導致mRNA會被外來體復合物或脫帽復合物降解。通過這種方式，可以快速降解翻譯不活躍的mRNA，而翻譯活躍的mRNA不受影響。
小干擾RNA
在后生生物中，由Dicer產(chǎn)生的小干擾RNA（siRNA）被整合到稱為RNA誘導沉默復合物（RISC）。該復合物含有內(nèi)切核酸酶，切割與siRNA結(jié)合的完全互補的mRNA，產(chǎn)生的片段然后被核酸外切酶降解。 siRNA通常用于實驗室細胞培養(yǎng)中阻斷基因的功能。SiRNA被認為是病毒先天免疫系統(tǒng)的一部分，可以用于對雙鏈RNA病毒的防御。
微小RNA
微小RNA（miRNA）是小RNA，通常與后生生物mRNA中的序列部分互補。 miRNA與mRNA的結(jié)合可以抑制該mRNA的翻譯并加速poly（A）尾部去除，從而加速mRNA降解。
結(jié)構與功能
從 (DNA）轉(zhuǎn)錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈（RNA），他作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定了核糖體合成肽鏈的種類。1961年F.雅各布和根據(jù)大腸桿菌誘導酶生成的實驗結(jié)果提出：信息從DNA到蛋白質(zhì)之間的轉(zhuǎn)移，必需有一種RNA起傳遞作用，由此提出了信使核糖核酸的名稱。
生物體內(nèi)的每種多肽鏈都由特定的mRNA編碼，所以細胞內(nèi)mRNA的種類很多，但通常每種mRNA的拷貝數(shù)極少（1～10個）。根據(jù)信息密碼學說，3個連續(xù)的核苷酸可以編碼一個氨基酸，因此從已知mRNA（或DNA）核苷酸順序可以準確推導出蛋白質(zhì)的一級結(jié)構。
存在范圍和性質(zhì)
mRNA存在于原核和真核生物的細胞質(zhì)及真核細胞的某些細胞器（如和）中。RNA病毒和RNA噬菌體中的 RNA既是遺傳信息的載體又具有mRNA的功能。生物體mRNA種類的多少與生物進化水平有關，高等生物所含的遺傳信息多，mRNA的種類也多。生物體內(nèi)某種mRNA的含量根據(jù)需要而有不同，如5齡蠶后部絲腺體的主要任務是快速合成大量絲心蛋白，因而編碼絲心蛋白的mRNA含量特別多。有些細菌需要不斷適應外部環(huán)境，其體內(nèi)編碼某些誘導酶的mRNA的含量也較多。
原核和真核生物mRNA不同的特點
①原核生物mRNA常以多順反子（見）的形式存在，即一條mRNA鏈編碼幾種功能相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。真核生物mRNA一般以單順反子的形式存在，即一種mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)。②原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯一般是偶聯(lián)的，即轉(zhuǎn)錄尚未完畢，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯合成就已開始 真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體則需經(jīng)后加工，加工為成熟的mRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成信息體后才開始工作 信息體中蛋白質(zhì)與RNA之比約為3。③原核生物mRNA半壽期很短，一般為幾分鐘，最長只有數(shù)小時（RNA噬菌體中的RNA除外）。真核生物mRNA的半壽期較長，如胚胎中的mRNA可達數(shù)日。④原核與真核生物mRNA的結(jié)構特點也不同。
一級結(jié)構與功能的關系
原核生物mRNA一般5'端有一段不翻譯區(qū)，稱前導順序，3'端有一段不翻譯區(qū)，中間是蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，一般編碼幾種蛋白質(zhì)。如大腸桿菌乳糖操縱子mRNA編碼3條多肽鏈；色氨酸操縱子mRNA編碼5條多肽鏈。也有單順反子形式的細菌mRNA，如大腸桿菌脂蛋白mRNA。原核生物mRNA分子中一般沒有修飾核苷酸，也沒有5'端帽子結(jié)構和3'端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的起始密碼子（AUG）附近（5'方向上游）的一小段長短不等的順序，含有較多的嘌呤核苷酸，被稱為SD順序。它能和核糖體小亞基上的16SrRNA的3'端富含嘧啶核苷酸的區(qū)域配對結(jié)合，有助于帶有甲酰甲硫氨酸的起始tRNA識別mRNA上的起始密碼（AUG），使肽鏈合成從此開始。這段順序是1974年由J.夏因和L.達爾加諾發(fā)現(xiàn)的，所以稱為SD順序，也稱核糖體結(jié)合部位。原核生物mRNA的編碼區(qū)一般編碼幾種功能上相關聯(lián)的蛋白質(zhì)，兩種蛋白質(zhì)的編碼區(qū)之間常有一小段不翻譯的順序，叫做間隔區(qū)。有的噬菌體RNA中2個相鄰的順反子共用一段相同的編碼順序，例如，M 噬菌體RNA中的溶菌蛋白編碼區(qū)共225個核苷酸中有189個核苷酸是由相鄰兩個蛋白質(zhì)共用的。原核mRNA與真核mRNA一樣使用同一套三聯(lián)體密碼子（真核生物線粒體mRNA有例外）。原核生物合成氨基酸的操縱子mRNA的5' 端前導順序上有一段順序稱作弱化子。弱化子具有兩種可以互變的構象，其中一種構象是轉(zhuǎn)錄終止的信號，能使轉(zhuǎn)錄中止（或衰減）。衰減調(diào)節(jié)是原核生物合成氨基酸的調(diào)控方式之一（見）。
真核生物 mRNA（細胞質(zhì)中的）一般由5'端帽子結(jié)構、5'端不翻譯區(qū)、翻譯區(qū)（編碼區(qū)）、3'端不翻譯區(qū)和3'端聚腺苷酸尾巴構成（圖1a[真核生物mRNA結(jié)構示意圖 a一級結(jié)構示意圖]）。分子中除 G構成帽子外，常含有其他修飾核苷酸，如 A等。5'端帽子結(jié)構通常有3種類型，即：G(5'）ppp(5')N； G(5')ppp(5') N和 G(5')ppp(5'） N。圖1b[真核生物mRNA結(jié)構示意圖b 5'端帽子結(jié)構式，，表示堿基]，表示堿基" class=image>[] 是帽子的化學結(jié)構，N右邊的m代表核糖2'位羥基的甲基化。真核細胞線粒體中的mRNA無帽子結(jié)構。一般認為帽子的功能與翻譯的啟動有關。許多真核生物 mRNA（如珠蛋白mRNA）除去帽子后翻譯效率大大降低。5'端不翻譯區(qū)，也叫前導順序。不同的真核mRNA的前導順序長度不同，有的只有10個核苷酸，有的則有200個核苷酸。與原核mRNA相似，真核mRNA5'端不翻譯區(qū)中常有一段順序與核糖體小亞基上的18SrRNA的3'端的一段順序互補并結(jié)合，這種結(jié)合與真核mRNA的翻譯啟動有關。
翻譯區(qū)（編碼區(qū)）使用的密碼子除線粒體（如人、牛和酵母線粒體）外與原核生物mRNA是一樣的。真核生物mRNA的起始密碼子都是AUG。真核和原核生物mRNA使用的密碼子也都有“簡并現(xiàn)象”，即幾種不同的密碼子翻譯出同一種氨基酸，但不同的mRNA中簡并密碼子的利用率是不同的，真核與原核生物之間的差別就更大。mRNA的終止密碼子有3個（UAG、UGA和UAA），其功能是停止翻譯，一般只用一個終止密碼子就能使翻譯停止。有的mRNA有2個連續(xù)的終止密碼子（見）。3'端不翻譯區(qū)的長短在不同的mRNA上有所不同，β珠蛋白mRNA只有39個核苷酸，而卵白蛋白mRNA則有637個核苷酸。真核生物mRNA3'端不翻譯區(qū)常有 AAUAA(A）或AUUUA(A）等順序，它們和識別多聚A聚合酶及裝配多聚A尾巴有關。除個別組蛋白mRNA外，真核生物mRNA3'端均有多聚A尾巴 3'端多聚A尾巴的長度隨來源不同而不同，且隨mRNA的老化而變短，通常有20～200個A。多聚A與mRNA穩(wěn)定性及mRNA從細胞核轉(zhuǎn)到細胞漿中有關。
真核生物mRNA的前體 真核生物mRNA通常都有相應的前體。從DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可稱作原始前體（或mRNA前體）。一般認為原始前體要經(jīng)過hnRNA核不均-RNA的階段，最終才被加工為成熟的 mRNA。hnRNA上的蛋白質(zhì)編碼區(qū)被一些居間順序分隔成若干段；不同的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所含的居間順序的數(shù)目不同，人胰島素只有兩個，而牛眼的晶體蛋白則含有數(shù)十個；居間順序的長短也各不相同，從數(shù)十個到上千個核苷酸（雞卵白蛋白有一個1550個核苷酸的居間順序）。居間順序?qū)⒃?/span>剪接過程中去除。約有10～40%的hnRNA含有3′端多聚A尾巴。hnRNA經(jīng)過進一步加工切除居間順序并把分隔的蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接起來，最終成為成熟的mRNA。
二級結(jié)構與功能的關系
DNA表達的信息需轉(zhuǎn)給一種“信使RNA”
真核生物mRNA也具有豐富的二級結(jié)構，如鴨珠蛋白mRNA和兔珠蛋白mRNA分別有45～60%和55～62%的核苷酸殘基處在堿基配對之中。在真核生物蛋白質(zhì)啟動復合物中，40S核糖體實際上覆蓋著mRNA上包括帽子結(jié)構在內(nèi)的50～54個核苷酸，但是40S核糖體的大小比50個核苷酸的長度小得多 由于形成的發(fā)夾結(jié)構（二級結(jié)構使帽子與起始密碼子之間的空間距離縮短）（圖3[真核生物mRNA ]），造成40S核糖體能夠覆蓋包括帽子結(jié)構和起始密碼子 AUG在內(nèi)的50多個核苷酸，從而啟動蛋白質(zhì)合成。不同的mRNA中發(fā)夾結(jié)構的有無或多少各不相同。在蛋白質(zhì)合成肽鏈繼續(xù)延伸時，不需要帽子結(jié)構參加，此時核糖體覆蓋的mRNA的區(qū)域約為25～35個核苷酸，mRNA的構象已不同于啟動階段而是處于一種伸展的狀態(tài)，從而有利于轉(zhuǎn)譯的延續(xù)。可見，折疊起來的mRNA二級結(jié)構有利于蛋白質(zhì)合成的啟動，以后mRNA處于伸展的狀態(tài)則有利于轉(zhuǎn)譯的繼續(xù)。
信使與密碼子
簡介
遺傳信息從DNA分子抄錄到RNA分子中的過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）。在真核生物中，最初轉(zhuǎn)錄生成的RNA稱為核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），然而在細胞漿中起作用，作為蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成模板的是mRNA（messenger RNA）。hnRNA是mRNA的未成熟前體。兩者之間的差別主要有兩點：一是hnRNA核苷酸鏈中的一些片段將不出現(xiàn)于相應的mRNA中，這些片段稱為內(nèi)含子（intron），而那些保留于mRNA中的片段稱為外顯子（exon）。也就是說，hnRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過程中經(jīng)過剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新連接在一起；二是mRNA的5′末端被加上一個m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一個多聚腺苷酸（polyA）尾巴。mRNA從5′末端到3′末端的結(jié)構依次是5′帽子結(jié)構，5′末端非編碼區(qū)，決定多肽氨基酸序列的編碼區(qū)，3′末端非編碼區(qū)，和多聚腺苷酸尾巴。多聚腺苷酸尾一般由數(shù)十個至一百幾十個腺苷酸連接而成。隨著mRNA存在時間的延續(xù)，這段聚A尾巴慢慢變短。因此，目前認為這種3′末端結(jié)構可能與增加轉(zhuǎn)錄活性以及使mRNA趨于相對穩(wěn)定有關。原核生物的mRNA沒有這種首、尾結(jié)構。
1961年，Jacob和Monod首先提出了mRNA的概念。在真核細胞中，由于蛋白質(zhì)是在胞漿中而不是在核內(nèi)合成，因此顯然要求有一個中間物將DNA上的遺傳信息傳遞至胞漿中。后來的研究證實，這種中間物即信使RNA.?mRNA的核苷酸序列與DNA序列相應，決定著合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。它如何指導氨基酸以正確的順序連接起來呢？不同的mRNA堿基組成和排列順序都不同，但都只有A，G，C，U4種堿基。如果一個堿基就可以決定一個氨基酸，則只有四種變化方式，如果兩個堿基決定一個氨基酸，則只有16種變化方式，都不能滿足20種氨基酸的需要。1961年Crick和Brenner的實驗得出了三個核苷酸編碼一個氨基酸的結(jié)論，并將這種三位一體的核苷酸編碼稱做遺傳密碼（genetic code）或三聯(lián)體密碼，這樣就可以有64種不同的密碼，但此情況下必須假定有一些氨基酸使用兩個以上的密碼。這一假定很快就被證明是對的。
遺傳密碼具特征
1．三個核苷酸組成一個密碼子，每個密碼子由三個前后相聯(lián)的核苷酸組成，一個密碼子只為一種氨基酸編碼。共有64個密碼子；
2．密碼子之間不重疊使用核苷酸，也無核苷酸間隔；
3．一種氨基酸可有多個密碼子，這個特點稱為密碼子的簡并性；
4．密碼子的通用性，所有生物從最低等的病毒直至人類，蛋白質(zhì)合成都使用同一套密碼子表（表15-8），僅有極少的例外，如特殊細胞器線粒體，葉綠體所用的密碼稍有不同。
通用遺傳密碼及相應的氨基酸
第一個核苷酸5′ 第二個核苷酸 第三個核苷酸3′
U C A G
苯丙氨酸 絲氨酸 酪氨酸半胱氨酸 C
亮氨酸 絲氨酸 終止碼 終止碼 A
亮氨酸 絲氨酸 終止碼 色氨酸 G
亮氨酸 脯氨酸 組氨酸 精氨酸 C
亮氨酸 脯氨酸谷氨酰胺 精氨酸 A
亮氨酸 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 G
異亮氨酸 蘇氨酸 天冬酰胺 絲氨酸 C
異亮氨酸 蘇氨酸 賴氨酸 精氨酸 A
蛋氨酸 蘇氨酸 賴氨酸 精氨酸 G
纈氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸 C
纈氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 A
纈氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 G
密碼子 通用編碼 線粒體編碼
UGA 終止碼 色氨酸 色氨酸 色氨酸 終止碼
AUA 異亮氨酸 蛋氨酸 蛋氨酸 蛋氨酸 異亮氨酸
CUA 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 蘇氨酸 亮氨酸
AGA 精氨酸 終止碼 絲氨酸 精氨酸 精氨酸
注：下標橫線者為與通用編碼不同的編碼
究竟哪一個密碼子為哪一種氨基酸編碼，即密碼子與氨基酸之間的對應關系已在60年代研究解決了。1964年Nirenberg用一種RNA聚合酶體外合成了多聚尿苷酸、多聚腺苷酸等多聚核苷酸，將這些多聚核苷酸分別用于蛋白質(zhì)的體外合成。發(fā)現(xiàn)，當所用的多聚核苷酸為多聚尿苷酸時，只有多聚苯丙氨酸合成，這意味著UUU為苯丙氨酸編碼；用其它多聚核苷酸進行相應的實驗后發(fā)現(xiàn)，CCC為脯氨酸編碼，而AAA為賴氨酸編碼；其后，有人又用核苷酸比例為已知，但是核苷酸序列隨機的多聚核苷酸，以及用已知序列的含兩種或兩種以上核苷酸的多聚核苷酸進行相應的實驗，將結(jié)果加以數(shù)理統(tǒng)計處理，又解讀了一批密碼子，其中包括三個終止碼，最后，還有一些密碼子是通過合成已知序列的三聚核苷酸與核蛋白體和載有放射性同位素標記的氨基酸的tRNA共沉淀原理予以解讀的。在所有密碼子中，AUG不僅為蛋氨酸編碼，而且又是翻譯（translation，以mRNA上的遺傳信息指導核蛋白體上多肽鏈合成的過程）的起始信號，UAA、UAG和UGA不為任何氨基酸編碼，而是作為翻譯的終止信號，統(tǒng)稱為終止碼（stop codon），又常被叫作無意義碼（nonsense codon）。
大多數(shù)氨基酸是由一個以上的密碼子所編碼。這個事實提出了一個問題：編碼同一種氨基酸的一組密碼子的使用頻率是否都相同？細致的分析表明，無論是原核生物，還是高等真核生物，密碼子的使用頻率并不是平均的，有些密碼子的使用率很高，有些則幾乎不使用，其使用頻率主要與細胞內(nèi)tRNA含量呈正相關。
傳遞
簡介
轉(zhuǎn)錄是在原核和真核細胞中以DNA為模板合成RNA的過程。
在原核和真核生物中，轉(zhuǎn)錄過程是相似的。包括DNA變性，RNA聚合酶結(jié)合在單鏈DNA上以5′→3′方向合成RNA分子。雙鏈中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄模板，合成單鏈RNA分子。啟動子和終止子序列決定轉(zhuǎn)錄的起始和終止。
在E.coli中RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄各種RNA（mRNA，tRNA和rRNA）。在真核細胞中有三類不同的RNA多聚酶，它們的功能不同。RNA pol Ⅰ轉(zhuǎn)錄4種rRNA中的3種；RNA pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄mRNA和一些snRNA；RNAⅢ轉(zhuǎn)錄第四種rRNA，tRNA以及其余的snRNA。
3種真核生物的RNA pol，不像E.coli RNA pol，沒有一個直接地和啟動子區(qū)結(jié)合，而是通過轉(zhuǎn)錄起始因子的介導來起始RNA的合成。對于每一種RNA多聚酶來說，轉(zhuǎn)錄因子是特異的，它可以識別啟動子的特殊序列。
蛋白質(zhì)編碼基因的啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，由不同組合的啟動原件所構成。特異的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子結(jié)合在這些原件上，促進RNA pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始。增強子離啟動子較遠，它可被調(diào)節(jié)因子識別結(jié)合，具有促進基因轉(zhuǎn)錄的功能。
由RNA pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄的啟動子，位于下游，在其基因編碼序列內(nèi)部。這種啟動子，根據(jù)所轉(zhuǎn)錄的RNA的種類，由不同的功能區(qū)組合而構成。轉(zhuǎn)錄因子識別這些功能區(qū)，促進RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始。
18S，5.8S和28S rRNA作為一個轉(zhuǎn)錄單位一道轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生前體RNA分子。大部分真核生物的18S，5-8S和28S rRNA都是以串聯(lián)重復排列，每個重復單位被不轉(zhuǎn)錄的間隔序列（nontranscribed specer,NTs）所分隔。轉(zhuǎn)錄單位的啟動子位于NTS中，其功能是和特異的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，促進RNA pol Ⅰ的轉(zhuǎn)錄起始。
中心法則的提出
從孟德爾定律問世以后，人們就知道了生物的各種性狀是由基因控制的。一基因一酶學說的建立進一步地明確了基因是以酶的形式通過控制生化反應鏈來控制的。酶或蛋白和基因又是什么樣的關系呢？也就是說遺傳信息怎樣傳遞，怎樣表達成性狀呢？就在Watson和Crick建立DNA雙螺旋模型后的第三年，1957年Crick提出了中心法測（central dogma），指出了遺傳信息的傳遞方向：
DNA → RNA→蛋白質(zhì)
DNA RNA →蛋白質(zhì)
也就是說由DNA通過轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給RNA，RNA通過翻譯把信息傳遞給蛋白。通過這種單向的傳遞，遺傳信息通過蛋白質(zhì)的不同形式，如酶，結(jié)構蛋白，運載蛋白，調(diào)節(jié)蛋白等表達成一種性狀。
與轉(zhuǎn)運區(qū)別
區(qū)分mRNA和tRNA，可以從結(jié)構和功能這兩個方面去把握。
結(jié)構
mRNA的一級結(jié)構，tRNA的二級、三級結(jié)構是經(jīng)常考察的內(nèi)容，需要仔細區(qū)分。
⑴真核生物的mRNA的5' 端有帽子結(jié)構，3' 端為多聚腺苷酸（poly(A））尾巴。
⑵tRNA的二級結(jié)構呈三葉草形。三葉草形結(jié)構由氨基酸臂、二氫尿嘧啶環(huán)、反密碼環(huán)、額外環(huán)和TφC環(huán)等5個部分組成。其中，氨基酸臂末端為CCA；反密碼環(huán)中部為反密碼子，由3個堿基組成。反密碼子可識別mRNA的密碼子。
⑶tRNA折疊形成三級結(jié)構。tRNA的三級結(jié)構呈倒L形，反密碼環(huán)和氨基酸臂分別位于倒L的兩端。
功能
⑴mRNA是合成蛋白質(zhì)的直接模板。每一種多肽鏈都有一種特定的mRNA做模板，因此細胞內(nèi)mRNA的種類也是很多的。它將DNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)錄下來，攜帶到核糖體上，在那里以密碼的方式控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序，作為蛋白質(zhì)合成的直接模板。
⑵tRNA的功能是轉(zhuǎn)運氨基酸。在蛋白質(zhì)合成過程中，tRNA與合成蛋白質(zhì)所需的單體——氨基酸形成復合物，將氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體中mRNA的特定位置上。
與反轉(zhuǎn)錄
簡介
定義：以反義RNA為模版，通過反轉(zhuǎn)錄酶，進行的RNA轉(zhuǎn)錄
信使RNA
2．反轉(zhuǎn)錄酶與反轉(zhuǎn)錄過程
反轉(zhuǎn)錄過程由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（cDNA）。反轉(zhuǎn)錄酶存在于一些RNA病毒中，可能與病毒的惡性轉(zhuǎn)化有關。人類免疫缺陷病毒（HIV）也是一種RNA病毒，含有反轉(zhuǎn)錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有反轉(zhuǎn)錄酶，推測可能與細胞分化和胚胎發(fā)育有關。
生物學意義
反轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)有重要的理論意義和實踐意義。
1．對分子生物學的中心法則進行了修正和補充，修正后的中心法則表示為：
可扼殺信使
microRNA雖然只有19－21個核苷長度，但能夠通過綁定和中和負責蛋白翻譯的信使RNA，沉默大片段基因。迄今發(fā)現(xiàn)的microRNA已達到幾百種，它們在基因組中的調(diào)節(jié)作用日益引起人們關注。
最近，Wistar研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)microRNA會經(jīng)歷一種生理學后果嚴重的分子編輯過程（molecular editing），序列的一個替換會改變這些microRNA的作用靶標，抑制非預期匹配物的表達，編輯過程出錯會導致嚴重的健康問題。詳細內(nèi)容刊登于2月23日《Science》雜志。
“我們發(fā)現(xiàn)，某些情況下已編輯的microRNA版本與未經(jīng)編輯的版本只有一個核苷差異，”文章高級作者、Wistar研究所基因表達和校準程序教授 Kazuko Nishikura博士說，“這些已編輯的microRNA不是由DNA編碼的，意味著至少兩個版本來自于同一個基因，這是未曾料到的……進一步觀察，我們發(fā)現(xiàn)替換只出現(xiàn)在分子的特定關鍵區(qū)域，總共19或21個核苷長度分子的第7或8位核苷，這兩個位點規(guī)定了靶標的特異性。提示替換可能會使已編輯的microRNA與未編輯的microRNA沉默完全不同的靶標。”
利用生物信息學工具將一種microRNA的已編輯版本和未編輯版本與已知的基因序列數(shù)據(jù)庫比對，研究人員鑒別出分別是兩種不同版本分子的靶標的兩組完全不同的基因，并從每組中分別挑選出三個基因，進一步觀察microRNA是否會改變這些基因的表達效果。
接下來，研究人員隨機挑選出一個預期的靶標基因，探測microRNA的衍生物的潛能。所挑選的基因為PRPS1，其所編碼的酶在尿酸合成中發(fā)揮關鍵作用。如果調(diào)節(jié)此酶不當，多種健康問題會接踵而來。比如，表達量過高會引起血液中尿酸水平上升，引起風濕痛；大腦中尿酸水平過高會損傷感覺神經(jīng)元，引起失聰。
Nishikura 說這些證實，最初計算機所預測的同一基因編碼的未經(jīng)編輯的、已編輯的microRNA的不同靶標是正確的。至少對于PRPS1來說是正確的，未經(jīng)編輯的和已編輯的microRNA的差異的生理學效果在尿酸水平的上升程度上顯示出來。
即便說PRPS1基因是研究人員隨機挑選的，但研究結(jié)果提示一系列其它迄今原因未明的疾病很有可能是由新發(fā)現(xiàn)的microRNA編輯過程引起的。
提取分離純化
真核細胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構特征是具有5’端帽子結(jié)構（m7G）和3’端的Poly(A）尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA
試劑準備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2) 2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6）；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6）、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6）；1mM EDTA(pH 8.0）；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC
操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC處理的1ml注射器或適當?shù)奈埽瑢⒐丫郏╠T）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A）尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
應用
2020年12月，美國食品和藥物管理局(FDA)授權一款運用mRNA(信使核糖核酸)技術研制的新冠疫苗的緊急使用許可。
2022年2月，南非一公司3日對當?shù)孛襟w表示，該公司利用已公開的新冠疫苗核酸序列，開發(fā)出非洲大陸首款mRNA（信使核糖核酸）新冠疫苗，計劃今年底前開展臨床試驗。
南非當?shù)貢r間2022年2月4日，據(jù)南非主流媒體報道，南非生物技術公司阿菲利根(Afrigen)日前已成功研制生產(chǎn)出非洲大陸首個mRNA新冠肺炎疫苗，該疫苗將于2022年11月正式投入臨床試驗。
2022年4月29日，斯微（上海）生物科技股份有限公司自主研發(fā)的新冠病毒mRNA疫苗已獲得國家藥監(jiān)局批準，將開展臨床試驗。
注意事項
1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。2．步驟⑷中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構，尤其是mRNA Poly(A+）尾處的二級結(jié)構，使Poly(A+）尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。5．一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。
參考資料
[1]
國際要聞回顧 · 中國科技網(wǎng)[引用日期2022-11-28]
[2]
第十七章 RNA的合成與加工 · 道客巴巴[引用日期2022-11-28]
[3]
用RTPCR對mRNA進行定量分析 · 道客巴巴[引用日期2022-11-28]
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